Ultrafiltracinio centrifugavimo vamzdžio naudojimas ir atsargumo priemonės
1) Pasirinkite tinkamą ultrafiltravimo vamzdelį.Atkreipkite dėmesį, kad UF membranos skiriasi savo tolerancijos lygiu įvairioms cheminėms medžiagoms.Paprastai ultrafiltravimo vamzdelius su 10 kDa molekulinės masės ribine riba galima pasirinkti su molekulinės masės riba, kuri neturi būti didesnė nei 1/3 dominančio baltymo molekulinės masės, pvz., 35 kDa.Jei dominančio baltymo molekulinė masė yra apie 10 kd, galima naudoti ultrafiltravimo vamzdelį, kurio molekulinės masės riba yra 3 KD.
(2) Šviežiai nupirktas ultrafiltravimas yra sausas, prieš naudojant įpilamas itin grynas vanduo, o vanduo visiškai praleidžiamas per membraną, ledo vonią arba šaldytuvą, atvėsintas kelias minutes.Tada nupilamas vanduo, ty baltyminis skystis, ir kiek įpilama, atsižvelgiant į tai, kuri yra ne daugiau nei balta linija vamzdelio viršuje.Operacija yra lengva, o prieš įpilant baltymų tirpalo ultrafiltravimo vamzdelį reikia atšaldyti ant ledo.
3) Ir masė, ir svorio centras turėjo pasiekti pusiausvyrą.Atkreipkite dėmesį, kad sukimosi greitis ir pagreitis nėra labai greiti, kitaip tiesiogiai pažeidžiama ultrafiltravimo membrana.Pradėtas išcentrinis ultrafiltravimas (centrifuga atšaldyta iki 4 laipsnių).Po to, kai skirtingų centrifugų RPM buvo konvertuotas į g, jis buvo kitoks.Centrifugos pagreitis buvo sureguliuotas iki minimumo, sumažinant slėgį membranoje.Atminkite, kad centrifugą išeikite iš centrifugos, kai centrifuga pasieks savo greitį arba jei turite problemų, pirmą kartą negalėsite su ja susitvarkyti.Membranos orientacija į veleną buvo sureguliuota pagal instrukcijas (kampinis centrifugos korpusas yra membrana statmenai ašiai).Praktikoje bendras sukimosi greitis yra mažesnis nei nurodytas instrukcijose, todėl centrifugos mėgintuvėlio tarnavimo laikas gali būti pratęstas.
3) Ir masė, ir svorio centras turėjo pasiekti pusiausvyrą.Atkreipkite dėmesį, kad sukimosi greitis ir pagreitis nėra labai greiti, kitaip tiesiogiai pažeidžiama ultrafiltravimo membrana.Pradėtas išcentrinis ultrafiltravimas (centrifuga atšaldyta iki 4 laipsnių).Po to, kai skirtingų centrifugų RPM buvo konvertuotas į g, jis buvo kitoks.Centrifugos pagreitis buvo sureguliuotas iki minimumo, sumažinant slėgį membranoje.Atminkite, kad centrifugą išeikite iš centrifugos, kai centrifuga pasieks savo greitį arba jei turite problemų, pirmą kartą negalėsite su ja susitvarkyti.Membranos orientacija į veleną buvo sureguliuota pagal instrukcijas (kampinis centrifugos korpusas yra membrana statmenai ašiai).Praktikoje bendras sukimosi greitis yra mažesnis nei nurodytas instrukcijose, todėl centrifugos mėgintuvėlio tarnavimo laikas gali būti pratęstas.
(4) Sukoncentravę iki likusio 1 ml, paimkite 50 ul buferinio tirpalo, įpilkite 10 ul srauto ir pažiūrėkite, ar nėra mėlynos spalvos, kad nustatytumėte, ar ultrafiltravimo mėgintuvėlyje trūksta baltymų.Jei vamzdelis nesandarus, iš naujo užpilkite viršutinį sluoksnį ir perpilkite į naują vamzdelį, kad pradėtumėte ultrafiltravimą.Norėdami tiksliai nustatyti, ar mėgintuvėliai nebuvo praleisti, centrifuguokite 10 minučių su 5 mg BSA prieš pratekėjimą, atlikdami baltymų klijais arba Bradfordo neapdorotą tyrimą, ir toliau įpilkite likusį koncentruotą baltymų tirpalą (kuris veikia ant ledo ir neleidžia baltymams įkaisti), kol visas koncentratas buvo pridėtas.Būkite atsargūs centrifuguodami, jei nusėda baltymai, dėl kurių vamzdis užsidaro.Jei atsiranda kritulių, nustatykite, ar konkreti kritulių priežastis yra per didelė baltymų koncentracija, ar netinkamas buferis;Pirmasis gali būti išspręstas ultrafiltruojant kelis ultrafiltravimo vamzdelius vienu metu, mažinant koncentraciją, o antrąjį keičiant skirtingais buferiniais tirpalais tol, kol baltymas nenusėda.
(4) Sukoncentravę iki likusio 1 ml, paimkite 50 ul buferinio tirpalo, įpilkite 10 ul srauto ir pažiūrėkite, ar nėra mėlynos spalvos, kad nustatytumėte, ar ultrafiltravimo mėgintuvėlyje trūksta baltymų.Jei vamzdelis nesandarus, iš naujo užpilkite viršutinį sluoksnį ir perpilkite į naują vamzdelį, kad pradėtumėte ultrafiltravimą.Norėdami tiksliai nustatyti, ar mėgintuvėliai nebuvo praleisti, centrifuguokite 10 minučių su 5 mg BSA prieš pratekėjimą, atlikdami baltyminius klijus arba Bradfordo neapdorotą tyrimą ir toliau įpilkite likusį koncentruotą baltymų tirpalą (kuris veikia ant ledo ir neleidžia baltymams įkaisti), kol visas koncentratas buvo pridėtas.Būkite atsargūs centrifuguodami, jei nusėda baltymai, dėl kurių vamzdis užsidaro.Jei atsiranda kritulių, nustatykite, ar konkreti kritulių priežastis yra per didelė baltymų koncentracija, ar netinkamas buferis;Pirmasis gali būti išspręstas ultrafiltruojant kelis ultrafiltravimo vamzdelius vienu metu, mažinant koncentraciją, o antrąjį keičiant skirtingais buferiniais tirpalais tol, kol baltymas nenusėda.
(5) Pirmieji keli žingsniai naudojami baltymui koncentruoti, o jei reikia pakeisti buferį, švelniai įpilkite naujo buferio (ultrafiltravimas per 0,22 um ultrafiltravimo membraną) iki maždaug 1 ml bendro baltymo ir tris kartus perkoncentruokite iki maždaug 1 ml. kartus iš eilės, o galutinis koncentruotas galutinis tūris priklauso nuo norimos baltymų koncentracijos, paprastai ne daugiau kaip 500 ul, bet ir iki 200 ul.Tris kartus pasiekti 1000 × ar daugiau, iš esmės tiek pat buferio pokyčio, kiek apskaičiuojama kiekvieną kartą prisodrinus tūrį mažiausiai 10 × arba tiek.
(5) Pirmieji keli žingsniai naudojami baltymui koncentruoti, o jei reikia pakeisti buferį, švelniai įpilkite naujo buferio (ultrafiltravimas per 0,22 um ultrafiltravimo membraną) iki maždaug 1 ml bendro baltymo ir tris kartus perkoncentruokite iki maždaug 1 ml. kartus iš eilės, o galutinis koncentruotas galutinis tūris priklauso nuo norimos baltymų koncentracijos, paprastai ne daugiau kaip 500 ul, bet ir iki 200 ul.Tris kartus pasiekti 1000 × ar daugiau, iš esmės tiek pat buferio pokyčio, kiek apskaičiuojama kiekvieną kartą prisodrinus tūrį mažiausiai 10 × arba tiek.
Paskelbimo laikas: 2022-11-09