PGR, yra polimerazės grandininė reakcija, kuri reiškia dNTP, Mg2+, pailgėjimo faktorių ir amplifikacijos stiprinimo faktorių pridėjimą į sistemą katalizuojant DNR polimerazei, naudojant pradinę DNR kaip šabloną ir specifinius pradmenis kaip išplėtimo pradinį tašką. Atliekant denatūravimo, atkaitinimo, pratęsimo ir tt etapus, dukterinės DNR grandinės replikacijos in vitro procesas, komplementarus pagrindinės grandinės šablono DNR, gali greitai ir konkrečiai amplifikuoti bet kurią tikslinę DNR in vitro.
1. Hot Start PCR
Įprasto PGR amplifikacijos pradžios laikas nėra PGR įrenginio įdėjimas į PGR įrenginį, o tada programa pradeda amplifikuoti.Kai sistemos konfigūracija baigta, prasideda stiprinimas, kuris gali sukelti nespecifinį stiprinimą, o karšto paleidimo PGR gali išspręsti šią problemą.
Kas yra karšto paleidimo PGR?Paruošus reakcijos sistemą, fermento modifikatorius išleidžiamas aukštoje temperatūroje (dažniausiai aukštesnėje nei 90°C) pradinėje reakcijos kaitinimo stadijoje arba „karšto paleidimo“ stadijoje, kad suaktyvėtų DNR polimerazė.Tikslus aktyvavimo laikas ir temperatūra priklauso nuo DNR polimerazės pobūdžio ir karšto paleidimo modifikatoriaus.Šis metodas daugiausia naudoja modifikatorius, tokius kaip antikūnai, afiniteto ligandai arba cheminiai modifikatoriai, siekiant slopinti DNR polimerazės aktyvumą.Kadangi kambario temperatūroje DNR polimerazės aktyvumas slopinamas, karšto paleidimo technologija suteikia didelį patogumą ruošiant kelias PGR reakcijos sistemas kambario temperatūroje, neprarandant PGR reakcijų specifiškumo.
2. RT-PGR
RT-PCR (atvirkštinės transkripcijos PGR) yra eksperimentinis metodas, skirtas atvirkštinei transkripcijai iš mRNR į cDNR ir naudojant ją kaip amplifikacijos šabloną.Eksperimentinė procedūra yra pirmiausia išgauti bendrą RNR audiniuose arba ląstelėse, naudoti Oligo (dT) kaip pradmenį, naudoti atvirkštinę transkriptazę cDNR sintezei, o tada naudoti cDNR kaip šabloną PGR amplifikacijai gauti tikslinį geną arba nustatyti geno ekspresiją.
3. Fluorescencinė kiekybinė PGR
Fluorescencinė kiekybinė PGR (realaus laiko kiekybinė PGR,RT-qPCR) nurodo fluorescencinių grupių įtraukimo į PGR reakcijos sistemą metodą, naudojant fluorescencinių signalų kaupimą, kad būtų galima stebėti visą PGR procesą realiuoju laiku, ir galiausiai naudojant standartinę kreivę kiekybiniam šablono analizei.Dažniausiai naudojami qPCR metodai yra SYBR Green I ir TaqMan.
4. Įdėtas PGR
Įdėta PGR reiškia dviejų PGR pradmenų rinkinių naudojimą dviem PGR amplifikacijos etapams, o antrojo raundo amplifikacijos produktas yra tikslinio geno fragmentas.
Jei pirmosios pradmenų poros (išorinių pradmenų) nesutapimas sukelia nespecifinio produkto amplifikaciją, tikimybė, kad tą pačią nespecifinę sritį atpažins antroji pradmenų pora ir toliau amplifikuotų, yra labai maža, todėl amplifikacija antrąja pradmenų pora, pagerėjo PGR specifiškumas.Vienas iš dviejų PGR etapų pranašumų yra tas, kad jis padeda amplifikuoti pakankamai produkto iš ribotos pradinės DNR.
5. Touchdown PGR
Touchdown PGR yra metodas, skirtas pagerinti PGR reakcijos specifiškumą koreguojant PGR ciklo parametrus.
Atliekant prisilietimą prie PGR, pirmųjų kelių ciklų atkaitinimo temperatūra nustatoma keliais laipsniais aukščiau už maksimalią pradmenų atkaitinimo temperatūrą (Tm).Aukštesnė atkaitinimo temperatūra gali veiksmingai sumažinti nespecifinį amplifikaciją, tačiau tuo pat metu aukštesnė atkaitinimo temperatūra apsunkins pradmenų ir tikslinių sekų atskyrimą, todėl sumažės PGR išeiga.Todėl per pirmuosius kelis ciklus atkaitinimo temperatūra paprastai sumažinama 1 ° C per ciklą, kad padidėtų tikslinio geno kiekis sistemoje.Kai atkaitinimo temperatūra sumažinama iki optimalios temperatūros, atkaitinimo temperatūra palaikoma likusius ciklus.
6. Tiesioginis PGR
Tiesioginis PGR reiškia tikslinės DNR amplifikavimą tiesiai iš mėginio, nereikia išskirti ir išvalyti nukleino rūgštis.
Yra du tiesioginio PGR tipai:
tiesioginis metodas: paimkite nedidelį mėginio kiekį ir įpilkite jį tiesiai į PCR pagrindinį mišinį PGR identifikavimui;
krekingo metodas: paėmus mėginį, įpilkite jį į lizatą, lizuokite, kad išsiskirtų genomas, paimkite nedidelį kiekį lizuoto supernatanto ir įpilkite į PCR Master Mix, atlikite PGR identifikavimą.Šis metodas supaprastina eksperimentinę darbo eigą, sumažina praktinį laiką ir išvengia DNR praradimo valymo etapų metu.
7. SOE PGR
Genų sujungimas naudojant sutapimo išplėtimo PGR (SOE PGR) naudoja pradmenis su viena kitą papildančiais galais, kad PGR produktai sudarytų persidengiančias grandines, kad vėlesnėje amplifikacijos reakcijoje, išplečiant persidengiančias grandines, būtų gauti skirtingi A technikos šaltiniai, kai amplifikuoti fragmentai sutampa. ir sujungti kartu.Ši technologija šiuo metu turi dvi pagrindines taikymo kryptis: sintezės genų konstravimas;į genų vietą nukreipta mutacija.
8. IPCR
Atvirkštinis PGR (IPCR) naudoja atvirkštinius komplementarius pradmenis, kad amplifikuotų kitus DNR fragmentus nei du pradmenys, ir amplifikuoja nežinomas sekas abiejose žinomo DNR fragmento pusėse.
IPCR iš pradžių buvo sukurtas gretimų nežinomų regionų sekai nustatyti ir dažniausiai naudojamas tiriant genų promotoriaus sekas;onkogeniniai chromosomų pertvarkymai, tokie kaip genų suliejimas, translokacija ir perkėlimas;ir viruso genų integracija, dabar taip pat dažnai naudojami. Vietinei mutagenezei nukopijuokite plazmidę su norima mutacija.
9. dPGR
Skaitmeninis PGR (dPCR) yra absoliutaus nukleorūgščių molekulių kiekybinio nustatymo metodas.
Šiuo metu yra trys nukleorūgščių molekulių kiekybinio nustatymo metodai.Fotometrija pagrįsta nukleorūgščių molekulių absorbcija;realaus laiko fluorescencinė kiekybinė PGR (realaus laiko PGR) yra pagrįsta Ct reikšme, o Ct reikšmė nurodo ciklo numerį, atitinkantį fluorescencijos vertę, kurią galima aptikti;skaitmeninis PGR yra naujausia Kiekybinė technologija, pagrįsta vienos molekulės PGR metodu nukleorūgščių skaičiavimui.
Paskelbimo laikas: 2023-06-13